ฟรานเซส เอลเลน เวิร์ก ชาวอเมริกันผู้เป็นพระปัยยิกา (ยายทวด) ของไดอานาไดอานากำเนิดในตระกูลสเปนเซอร์ ซึ่งเป็นหนึ่งในตระกูลขุนนางอังกฤษเก่าแก่ ปัจจุบันสมาชิกในสายตระกูลนี้ยังคงสืบทอดฐานันดรศักดิ์ ดยุกแห่งมาร์ลบะระ เอิร์ลสเปนเซอร์ เอิร์ลแห่งซันเดอร์แลนด์ และ ไวเคานท์เชอร์ชิลล์[302][303] ต้นตระกูลสเปนเซอร์อ้างตัวว่าเป็นผู้สืบสายโลหิตโดยตรงของทายาทสายย่อยตระกูล เดสเปนเซอร์ ซึ่งเป็นตระกูลที่ทรงอำนาจในสมัยกลาง แต่ว่าความน่าเชื่อถือของคำอ้างนี้ยังคงมีข้อสงสัยอยู่หลายประการ[304]  

พระปัยยิกา (ย่าทวด) ของไดอานา คือ มาร์กาเร็ต บาริง ซึ่งมาจากตระกูลคหบดีนายธนาคารเชื้อสายอังกฤษ–เยอรมัน และเป็นบุตรีของ เอ็ดวาร์ด บาริง บารอนเรเวลสโตกที่ 1[305][306] 

ไดอานามีพระญาติห่าง ๆ ในสาขาตระกูลสเปนเซอร์เป็นขุนนางคือ จอห์น เชอร์ชิลล์ ดยุกแห่งมาร์ลบะระที่ 1 และเจ้าชายแห่งมินเดลไฮม์[307] 

ไดอานาและเจ้าชายชาลส์มีบรรพบุรษร่วมกัน เนื่องจากทั้งสองพระองค์สืบเชื้อสายจากราชวงศ์ทิวดอร์ ผ่านสายพระโลหิตพระเจ้าเฮนรีที่ 7 แห่งอังกฤษ[308] ไดอานามีเชื้อสายสกอตจากราชวงศ์สจวต ผ่านสายพระโลหิตพระเจ้าชาลส์ที่ 2 แห่งอังกฤษ โดย ชาลส์ เลนนิกซ์ ดยุกแห่งริชมันด์ที่ 1 และเฮนรี ฟิทซ์รอย ดยุกแห่งแกรฟตันที่ 1  และสืบสายพระโลหิตของพระเจ้าเจมส์ที่ 2 แห่งอังกฤษ ผ่านเฮนเรียตตา ฟิทซ์เจมส์ บุตรีนอกสมรสของพระองค์ [22][19][309]

นอกจากนี้ ไดอานามีพระปัยยิกา (ยายทวด) ฟรานเซส เอลเลน เวิร์ก เป็นชาวอเมริกัน ซึ่งเป็นบุตรีของนายหน้าซื้อขายหลักทรัพย์ผู้มั่งคั่งแห่งไอไฮโอ แฟรงคลิน เอช. เวิร์ก[310] และฟรานเซสได้สมรสกับเจมส์ โรช บารอนแห่งเฟอร์มอยที่ 3 

มีการค้นพบหลักฐานคำบรรยายเกี่ยวกับลักษณะของ เอลิซา เควาร์ก ผู้เป็นยายเทียดของไดอานาว่าเป็นหญิงสาวรับใช้ชาวพื้นเมืองอาร์เมเนียผิวสี อาศัยในเมืองบอมเบย์ ประเทศอินเดีย และต่อมาได้ตั้งครรภ์กับธีโอดอร์ ฟอร์บส์ ชาวอังกฤษ และมีบุตรีด้วยกันหนึ่งคน ชื่อว่า แคเธอริน สกอตต์ ฟอร์บส์[311][312] ทั้งนี้วิลเลียม แอดดัมส์ ไรท์วีสเนอร์ นักวงศาวิทยา ตั้งข้อสันนิษฐานว่าเอลิซาอาจเป็นชาวอาร์เมเนีย[313]

ในเดือน มิถุนายน พ.ศ.​ 2556 กลุ่ม BritainsDNA ประกาศว่า ผลการทดสอบทางพันธุกรรมจากพระญาติห่าง ๆ ของไดอานา ซึ่งเป็นทายาทสายตรงฝั่งพระมารดา ยืนยันผลว่า เอลิซา เควาร์ก มีเชื้อสายอินเดีย เนื่องจากตรวจพบหน่วยเกลียวดีเอ็นเอไมโทคอนเดรียชนิดพิเศษในตัวอย่างดีเอ็นเอของพระญาติซึ่งพบเฉพาะในชาวอินเดียและส่งผ่านได้เฉพาะจากแม่สู่ลูกเท่านั้น[314][315][316][317][318]

พงศาวลีของไดอานา เจ้าหญิงแห่งเวลส์

16. เฟรเดริก สเปนเซอร์ เอิร์ลสเปนเซอร์ที่ 4               8. ชาลส์ สเปนเซอร์ เอิร์ลสเปนเซอร์ที่ 6                       17. เอดิเลด เซย์มัวร์               4. อัลเบิร์ต สเปนเซอร์ เอิร์ลสเปนเซอร์ 7                             18. เอ็ดเวิร์ด บาริง บารอนเรเวลสโตกที่ 1               9. มาร์กาเร็ต แบริง                       19. ลุยซา บูลทีล               2. จอห์น สเปนเซอร์, เอิร์ลสเปนเซอร์ที่ 8                                   20. เจมส์ แฮมิลตัน ดยุกแห่งเอเบอร์คอร์นที่ 2               10. เจมส์ แฮมิลตัน ดยุกแห่งเอเบอร์คอร์นที่ 3                       21. เลดี้แมรี เคอร์ซอน-ฮาว               5. เลดี้ซินเธีย แฮมิลตัน                             22. ชาลส์ บิงแฮม เอิร์ลลิวคานที่ 4               11. เลดี้โรซาลินด์ บิงแฮม                       23. เลดี้เซซิเลีย กอร์ดอน-เลนนิกซ์               1. ไดอานา เจ้าหญิงแห่งเวลส์                                         24. เอ็ดมันด์ โรช บารอนเฟอร์มอยที่ 1               12. เจมส์ โรช บารอนเฟอร์มอยที่ 3                       25. เอลิซาเบธ คาโรไลน์ บูธบี               6. มัวริซ โรช บารอนเฟอร์มอยที่ 4                             26. แฟรงคลิน เอช. เวิร์ก               13. ฟรานเซส เอลเลน เวิร์ก                       27. เอลเลน วู้ด               3. ฟรานเซส โรช                                   28. อเล็กซานเดอร์ อ็อกสตัน กิลล์               14. วิลเลียม สมิธ กิลล์                       29. บาร์บารา สมิธ มาร์               7. รูธ กิลล์                             30. เดวิด ลิตเติลจอห์น               15. รูธ ลิตเติลจอห์น                       31. เจน ครอมบี